Clin Transl Med︱耶鲁大学刘延盛团队通过磷酸化蛋白质组学揭示二甲双胍在结直肠癌细胞中的作用机制
二甲双胍是2型糖尿病（T2D）的一线治疗药物。越来越多的证据表明，二甲双胍治疗还有多种益处，包括肥胖患者减重、心肾保护、神经保护、整体健康改善和降低癌症风险等。ClinicalTrials.gov上显示二甲双胍相关的癌症临床试验高达400项。例如，结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症类型之一，前人研究发现T2D患者发展CRC的风险增加了30%，而二甲双胍使用可将T2D患者的CRC风险降低29％，同时减少患者的特异性死亡率[1-2]。磷酸化蛋白质组学是研究复杂信号通路与网络的利器，能否利用磷酸化蛋白质组学技术探究神药二甲双胍的抗癌活性[3]？
研究首先选取了代表CRC的5个不同临床蛋白质组亚型 (CPS1-CPS5) [4] 的12种细胞系（图1A），并在使用10mM二甲双胍前培养24小时以到达营养消耗状态[3]。此后，分别在加入二甲双胍30分钟和24小时后利用DIA技术深入定量分析蛋白质组还是磷酸化蛋白质组的变化（图1B-D）。主成分分析显示，12种不同CRC细胞株在二甲双胍短期和长期干预后CRC蛋白组表达水平上变化一直很小，但在24小时后磷酸化蛋白组的变化明显，且表现呈高度异质性（图1E），提示二甲双胍对磷酸化信号网络的系统重塑。
图1 12种结直肠癌细胞中蛋白质组和磷酸化蛋白质组对二甲双胍的响应
（图源：Salovska, Gao, Müller-Dott et al., Clin Transl Med, 2023）
研究数据进一步显示，二甲双胍在CRC细胞的长期效果（24h）较短期（30min）变化更明显（图2）。有意思的是，即使在24h的数据中，MDST8和NCI- H747两种细胞的磷酸化蛋白质组仅仅变化了0.8%和4.1%，而另外10种CRC细胞株则有13.8%-41.9%的磷酸化位点发生了显著变化。然而，仅仅有0.08%的磷酸化位点变化被这10种细胞系所共有，强烈提示二甲双胍对CRC磷酸化蛋白质组影响的个体异质性。
图2 二甲双胍作用30min和24h蛋白质组和磷酸化蛋白质组的变化对比
（图源：Salovska, Gao, Müller-Dott et al., Clin Transl Med, 2023）
考虑到上述异质性，作者建立MetScore评分系统为每个磷酸化位点打分以量化其在所有细胞系中的反应（-12到+12分），并根据变化程度把所有磷酸化位点分成5个级别，G1-G5。如G1部分是至少有四个细胞系出现该位点几乎全部上调，G5则是是至少有四个细胞系下调。通过比较G1和G5的motif序列（图3A-B），发现二甲双胍倾向于优先下调MAPKs、CDKs与mTOR。相反，AMPK与AKT的底物motif则被激活。作者也从OmniPath数据库[5]中提取的已知激酶靶点与信号通路进行了富集分析（图3C-F）。以MetScore评分系统对每个磷酸化位点赋分，成功鉴定到了与二甲双胍相关的一系列新位点（图4）。
图3 使用MetScore打分鉴定二甲双胍相关磷酸化位点基序和功能富集分析
（图源：Salovska, Gao, Müller-Dott et al., Clin Transl Med, 2023）
图4 “二甲双胍通路”的新磷酸化位点的发现
（图源：Salovska, Gao, Müller-Dott et al., Clin Transl Med, 2023）
多项研究已经表明，二甲双胍的已知作用机制主要依托于激活AMPK以及抑制mTOR通路，但其完整和具体的作用机制依旧尚未明确。为了进一步深入了解二甲双胍在单个细胞系中的药物作用机制，作者使用PHONEMeS软件[6]重建了连贯的信号调控路径，将激酶与底物磷酸化位点连接起来，从而形成一个大的信号网络以囊括与解释某种细胞中所有显著变化的磷酸化位点。作者抽取AMPK信号通路子网络展示分析其上游调控因子及下游效应因子（图5），发现AMPK子网络在不同细胞的环境中变化很大，如AMPK本身的活性在COLO205细胞出现了下调的情况。
图5 PHONEMeS进行的网络分析揭示了CRC细胞中以AMPK为焦点的子网络的显著异质性
（图源：Salovska, Gao, Müller-Dott et al., Clin Transl Med, 2023）
最后，作者将磷酸化蛋白质组对二甲双胍响应的定量变化与药物-磷酸化蛋白质组学资源（如ATLANTiC数据库[7]）比对（图6A），并结合了P100的重点磷酸化相关性的分析方法[8]（图6B），筛选出可能与二甲双胍相互作用的药物分子，发现零星的前人实验已经证实了二甲双胍可以增强部分药物的抗癌效果。作者最后选取了六种药物化合物进行细胞生长抑制实验的验证（图6C-E），取得了较好的结果；其中，初步发现Navitoclax (一种Bcl-2蛋白家族抑制剂)的抑癌效果被二甲双胍显著增强。
图6 二甲双胍与CRC抗肿瘤药物的协同作用
（图源：Salovska, Gao, Müller-Dott et al., Clin Transl Med, 2023）
第一作者：高尔立（左）；通讯作者：刘延盛（右）
（照片提供自：高尔立/刘延盛团队）
刘延盛，耶鲁大学助理教授，研究组长，博士生导师。课题组主要从事蛋白质组学的技术研发、蛋白质翻译后修饰与更新、以及遗传疾病与癌症等方面的研究。刘博士作为通讯作者或（共同）第一作者在Cell、Nat Biotech（2篇）、Dev Cell、PNAS、Nat Commun（2篇）、Sci Adv、Cell Rep（2篇）、Nucleic Acids Res、Mol Syst Bio（3篇）、Anal Chem、 Clin Transl Med等杂志发表论文65余篇，总引用6700余次。近年来，担任Proteomics编委, Proteomics-Clinical applications编委，Review Commons咨询专家编委，HUPO颁奖委员会成员与教育培训委员会成员。近年来获美国质谱学会研究奖，HUPO青年科学家2021年度最佳论文奖，美国生物化学学会会议青年科学家奖，美国质谱学会2019年度新人科学家等多项奖项（联系方式：yansheng.liu@yale.edu，课题组网站https://www.yslproteomics.org/）。
高尔立，苏州大学附属第一医院普外科副主任医师，硕士生导师，获江苏省卫生国际交流支撑计划青年医师海外研修项目支持，于2018-2020年任耶鲁大学访问学者（刘延盛实验室）。以通讯/第一作者在Clin. Transl. Med、 Molecular Omics、Frontiers in Genetics、J ONCOL、Med.Biomed Res.Int.等国际主流期刊发表论文10余篇,参与包括国家重点863计划、基金委青年及面上项目等3项国家级课题和主持一项苏州市课题。课题组长期从事乳腺癌临床及基础研究（elgao@suda.edu.cn），欢迎感兴趣的学生学者合作！
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